病毒學評估住院患者covid - 2019gydF4y2Ba

SARS冠狀病毒基因有密切關係(冠)和COVID-19的病原體,SARS-CoV-2。主要的ACE2表達下呼吸道被認為是確定SARS的自然曆史下呼吸道的感染gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。盡管積極的臨床標本檢測SARS-CoV-2上呼吸道此前被描述gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba},這些觀察不解決非典和COVID-19之間的主要差異在臨床病理學方麵。研究的患者是入學,因為他們獲得在已知的密切接觸感染指數情況,從而避免由於症狀病例定義表征偏見。所有患者在接受治療一個醫院在慕尼黑,德國。病毒學檢測是由兩個緊密合作實驗室使用相同的標準的技術與逆轉錄PCR (rt - PCR)和病毒隔離;這兩個實驗室確認彼此的結果在幾乎所有的個體樣本。由於極高的結果一致,血清學資料除外的所有數據(基於結果從一個實驗室)——提出了在一起。病人是集群的一部分相關的流行病學病例發生在2020年1月23日在慕尼黑,發現1月27日(ref。gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba)。本研究使用樣本在醫院的臨床過程,以及入學前從最初的診斷測試。在情況下,最初的診斷測試是由其他實驗室、原始樣本檢索和重新測試的嚴格的質量標準下當前的研究。gydF4y2Ba

先了解上述臨床表現是否感染SARS-CoV-2單方麵造成的,所有患者樣本測試一組典型的呼吸道病毒感染的代理人,包括人類冠狀病毒(HCoV) -HKU1 HCoV-OC43, HCoV-NL63和HCoV - 229 e,流感病毒,流感病毒B, phinovirus,腸病毒、呼吸道合胞病毒、人類副流感病毒病毒1 - 4,人類metapneumovirus腺病毒和人類bocavirus。沒有檢測到任何病人合並感染。gydF4y2Ba

所有患者最初的rt - pcr診斷奧羅或鼻咽拭子標本gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。這兩種類型的標本收集在所有患者在整個臨床過程。沒有明顯的差異在病毒載量或檢出率比較naso和口咽拭子(圖。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。最早的拭子是第一天的症狀,這通常是非常輕微或前驅的。所有拭子從病人第一天到第五天檢測呈陽性。病毒RNA的平均負荷為6.76×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba副本每擦拭,直到第五天,最大負載為7.11×10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba拷貝/拭子。拭子樣本後第五天平均3.44×10的病毒載量gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba副本/拭子,檢出率為39.93%。最後拭子樣本陽性拍攝於後28天出現症狀。平均病毒載量痰是7.00×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba拷貝/毫升,最大值為2.35×10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba拷貝/毫升。gydF4y2Ba

因為拭子樣本有限例SARS的早期診斷的敏感性gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba},我們首先分析了成對拭子和痰液樣本在同一場合從七個病人。所有采集標本後2 - 4天出現症狀。在兩種情況下,拭子樣本病毒濃度明顯高於痰液樣本,顯示不同閾值周期(> 3的gydF4y2BaCgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba)值。相反的是真的在兩個情況下,剩下的三個案例有類似的濃度在兩個樣本類型。gydF4y2Ba

所有27個尿樣和沒有31從SARS-CoV2 RNA陽性血清樣本。gydF4y2Ba

要理解傳染性,我們試圖從臨床樣本活病毒隔離在多個場合(無花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。而病毒容易孤立在第一周的症狀相當大的一部分樣品(16.66%的拭子和83.33%的痰樣本),沒有隔離獲得樣本後第8天盡管持續的高病毒載量。gydF4y2Ba

病毒隔離從糞便樣本從未成功,無論病毒RNA濃度,共有13個樣本的基礎上,從4天6和12之間的病人。病毒隔離的成功也取決於病毒載量:樣本包含< 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba拷貝/毫升每樣(或副本)從未產生的孤立。痰液樣本,基於概率單位模型插值是為了獲得實驗室傳染性病人的出院標準(無花果。gydF4y2Ba1 f, ggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

高病毒載量和成功隔離從早期喉部拭建議潛在的病毒複製在上呼吸道的組織。獲得活躍的病毒複製的證據缺乏組織病理學的情況下,我們直接進行rt - pcr檢測識別病毒subgenomic mrna在臨床樣品(擴展數據圖。gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。病毒subgenomic mRNA轉錄隻在感染細胞和沒有包裝成病毒粒子,因此表明積極的存在被感染的細胞樣本。病毒subgenomic mRNA水平比較對病毒基因組RNA在同一個樣本。在痰液樣本9天4天,在此期間活躍複製在所有患者痰是顯而易見的按縱向病毒載量課程(詳見“病毒載量、抗體反應和臨床課程”),意思是每個基因組規範化subgenomic mRNA的比率約為0.4%(圖gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。從每天10到11日發生了下降。在喉部拭,所有樣本到第五天在同一個範圍,而沒有subgenomic mRNA在拭子檢測。總之,這些數據顯示SARS-CoV-2活躍複製的喉嚨在出現症狀後的前五天。沒有(或很少)複製的跡象在凳子上獲得的相同的方法(無花果。gydF4y2Ba1克gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在我們的研究中,我們從所有患者完整的病毒基因組測序。G6446A交易所首次檢測到在一個病人,後來傳播到集群中的其他病人gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba。在第一個病人,這種突變被發現在一個咽喉拭子在同一天的痰樣本顯示原來的等位基因(G6446)。的單核苷酸多態性分析rt - pcr和Sanger測序序列樣本可以從病人(表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。不同基因型的存在在咽喉拭子和痰強烈支持我們懷疑獨立病毒複製的喉嚨,而不是被動的脫落的喉嚨肺。gydF4y2Ba

每日測量病毒載量的痰,咽拭子和凳子在圖中做了總結。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。一般來說,病毒RNA的含量是非常高的初始樣本。在所有的病人,隻有一個除外,病毒RNA的濃度在咽喉拭子似乎已經在下降的時候第一次演講。痰拒絕更慢病毒RNA濃度,高峰期間的第一個星期在三8位患者的症狀。凳子的病毒RNA濃度也高。在許多情況下,病毒RNA濃度的凳子似乎反映了在痰(圖。gydF4y2Ba2 a - cgydF4y2Ba)。在一種情況下才獨立複製的腸道是顯而易見的從糞便RNA的排泄(無花果。gydF4y2Ba二維gydF4y2Ba)。而主要症狀消退,直到第一周(表的結束gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),仍可檢測的病毒RNA在喉部拭到第二個星期。凳子和痰液樣本仍然RNA-positive超過三個星期6的九個病人,盡管完全解決症狀。gydF4y2Ba

所有病例相對溫和的課程(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。這兩個病人顯示出一些肺部感染的跡象是唯一的情況下,痰病毒載量顯示晚,高峰10或11天,而痰病毒載量下降這一次在所有其他病人(無花果。gydF4y2Ba2 f, ggydF4y2Ba)。值得注意的是,四個顯示的九個病人喪失味覺和嗅覺感覺,並描述了這種損失比感冒更強大和更持久的疾病。gydF4y2Ba

血清學檢測免疫球蛋白g和IgM使用細胞表達的蛋白免疫熒光SARS-CoV-2並使用SARS-CoV-2病毒中和試驗(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,擴展數據圖。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。血清轉化在50%的病人發生7天,而在所有患者白天14(圖。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba)。沒有病毒隔離後7天。所有患者顯示檢測到中和抗體滴定度的不建議與臨床密切相關的課程。值得注意的是,病人沒有。4,顯示最低的病毒中和滴定度在星期2,似乎擺脫病毒從凳子上長時間(無花果。gydF4y2Ba二維gydF4y2Ba)。微分重組免疫熒光試驗結果表明對四大或cross-stimulation流行人類冠狀病毒在幾個病人(擴展數據表gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在病人的臨床課程學習的年輕到中年專業人士沒有顯著的潛在疾病溫和。除了一位病人之外,所有病例第一次測試當症狀仍溫和或前驅期(一段時間中,大多數患者會出現一次大規模流行病傳播的一般認識gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)。診斷測試表明,簡單的咽喉拭子將提供足夠的靈敏度的感染在這個階段。這是“非典”形成鮮明對比;例如,隻有38 98鼻或鼻咽拭子樣本的rt - pcr檢測呈陽性的SARS患者在香港gydF4y2Ba^15gydF4y2Ba。非典和COVID-19之間的病毒載量也大大不同。非典,花了7到10天之後出現症狀直到RNA濃度峰值(5×10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba副本每拭子)gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba}。在目前的研究中,濃度達到峰值前5天,超過1000倍。成功的活病毒隔離COVID-19咽喉拭子是另一個顯著的區別,非典,這種隔離是很少成功gydF4y2Ba^{16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}。這表明病毒複製活躍在上呼吸道的組織,在冠並不認為複製盡管探測ACE2表達gydF4y2Ba^{19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba}。同時,ACE2作為受體的並發使用冠狀和SARS-CoV-2對應於一個高度相似的排泄動能在痰,肺與活躍的複製。冠之前發現gydF4y2Ba^13gydF4y2Ba在痰液平均濃度1.2 - -2.8×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba拷貝/毫升,這對應於觀測。gydF4y2Ba

而證明複製的組織病理學是等待,擴展組織取向與複製SARS-CoV-2喉嚨強烈支持我們的研究的細胞轉錄subgenomic mRNA在咽喉拭子樣本,尤其是在第一個5天的症狀。顯著的額外證據獨立複製序列的發現提供的喉嚨在一個病人,他始終表現出截然不同的病毒在喉嚨而不是肺。此外,味覺和嗅覺點的幹擾組織的上呼吸道感染。gydF4y2Ba

至關重要的是,大多數患者在當下研究似乎超出了脫落的峰值在樣本上呼吸道當他們第一次測試,而傳染性病毒的脫落在痰貫穿症狀的第一個星期。這些發現表明一個更有效的傳播比冠SARS-CoV-2,通過積極咽病毒一次脫落的症狀仍然是溫和的和典型的上呼吸道感染。疾病後期,COVID-19類似非典的複製下呼吸道。值得注意的是,這兩個病人表現出一些症狀的肺顯示痰持續的病毒載量的影響。我們的研究是有限的,沒有觀察到嚴重的病例。未來的研究,包括嚴重的病例的預後價值應該看看病毒載量的增加超出了第一周的結束,可能表明症狀的加重。gydF4y2Ba

最有趣的一個假設來解釋取向的潛在擴展到喉嚨的存在多元furin-type裂解位點在S1-S2結SARS-CoV-2高峰在冠狀蛋白質,不存在gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba。插入S1-S2地區多元裂解位點的冠曾導致溫和,但明顯,gain-of-fusion活動可能導致增加病毒進入組織的低密度ACE2表達gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

的組合非常高濃度的病毒RNA和偶爾的檢測細胞的糞便含有subgenomic mRNA表明胃腸道活躍的複製。活躍的複製也提出了更高的檢出率比中東的呼吸係統冠狀病毒(MERS-CoV),而stool-associated RNA隻有14.6%的樣本中發現了37個住院病人在利雅得(沙特阿拉伯)gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}。如果SARS-CoV-2隻是被動地出現在凳子上(如後吞下呼吸道分泌物),類似的檢出率MERS-CoV預計將。複製在胃腸道還支持通過與冠類比,定期排出的糞便(可能是孤立的細胞培養gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba)。我們未能隔離生活SARS-CoV-2從大便可能是由於輕度課程的情況下,隻有一個案例顯示間歇性腹瀉。在中國,腹瀉是隻有2 99例gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba。進一步的研究應該地址是否SARS-CoV-2在大便呈現非傳染性的雖然與腸道接觸的環境。我們的初步結果表明,措施,以遏製病毒傳播應該瞄準滴,而非汙染物——基於傳播。gydF4y2Ba

痰是相關的長期病毒傳染不僅對醫院感染的控製,而且對放電管理。情況的特點是一個容量有限的醫院傳染病病房的床上,早期出院後治療的壓力。在目前的基礎上發現,早期放電在隨後的家庭隔離可以為病人選擇超出第十天的症狀和不到每毫升100000病毒RNA複製的痰。兩個標準預測,幾乎沒有剩餘風險的傳染性,細胞培養的基礎上。gydF4y2Ba

所有病人的血清學課程表明血清轉化的時間相似,或略早於冠感染gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。血清轉化在大多數情況下,“非典”發生在第二周的症狀。非典和事情IgM沒有發現明顯早於免疫球蛋白免疫熒光;這可能部分是由於技術原因,免疫球蛋白抗體的高活動性比IgM病毒抗原表位的測定。免疫球蛋白損耗隻能部分地減輕這種影響。因為免疫熒光試驗是一個勞動密集型的方法,酶聯免疫吸附試驗檢測應作為一種篩選試驗開發。中和測試必須排除可交叉反應的抗體針對人類冠狀病毒流行。頻繁的基礎上低中和抗體滴定度觀察到冠狀病毒感染gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba},我們開發了一個特別敏感的蝕斑減少中和試驗。考慮到滴定度我們觀察到,一個簡單的microneutralization測試格式可能在常規應用程序提供足夠的靈敏度和人口研究。gydF4y2Ba

對齊的病毒載量的課程時,似乎沒有突然消除病毒血清轉化的時候。相反,在第2周恰逢早期血清轉化緩慢但穩定的下滑痰的病毒載量。屬性是否如糖蛋白的糖基化模式在關鍵地點有一個角色的衰減中和抗體反應需要進一步澄清。在任何情況下,疫苗方法主要針對誘導的抗體反應應該引起特別強大的抗體反應是有效的。gydF4y2Ba

沒有統計方法被用來預先確定樣本容量。實驗沒有隨機和調查人員沒有被分配在實驗和結果評估。gydF4y2Ba

臨床樣品和病毒載量轉換gydF4y2Ba

痰液和糞便樣本和裝在本地條件。Oro -和鼻咽咽喉拭子被保存在3毫升的病毒傳輸介質。病毒載量在痰樣本預測RNA拷貝/毫升,在糞便樣本冊每g和喉部拭副本3毫升,假設所有樣本組件停牌3毫升病毒傳輸介質。拭子樣品懸浮在少於3毫升病毒傳輸媒介,這種轉換是適應代表副本/整個拭子。聚合概述每天收到的樣品從所有病人疾病的發病後圖所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

rt - pcr SARS-CoV-2和其他呼吸道病毒gydF4y2Ba

rt - pcr的目標使用gydF4y2BaEgydF4y2Ba和gydF4y2BaRdRpgydF4y2Ba基因如前所述gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba。兩個實驗室使用pre-formulated寡核苷酸混合物(Tib-Molbiol)實驗室程序更可再生的。所有患者也進行其他呼吸道病毒檢測,包括HCoV-HKU1 HCoV-OC43, HCoV-NL63和hcov - 229 e,流感病毒,流感病毒B,鼻病毒、腸道病毒、呼吸道合胞病毒、人類副流感病毒病毒1 - 4,人類metapneumovirus腺病毒和人類bocavirus使用LightMix-Modular化驗(羅氏)。額外的補充方法提供了技術細節部分gydF4y2Ba1克ydF4y2Ba。gydF4y2Ba

病毒隔離gydF4y2Ba

病毒隔離在兩個實驗室在州立E6細胞。總之,100μl暫停,清除和過濾的臨床樣本與同等體積的混合細胞培養基。上層清液收集後0、1、3和5天,用rt - pcr分析。額外的補充方法提供了技術細節部分gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

血清學gydF4y2Ba

我們進行了重組免疫熒光化驗,以確定具體的反應對重組蛋白在VeroB4細胞,如前所述gydF4y2Ba^{26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba}。這個試驗用一個克隆的冠狀病毒蛋白質從hcov - 229 e, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-HKU1或SARS-CoV-2。篩選1:10稀釋。蝕斑減少中和試驗是為MERS-CoV做基本上如前所述gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba。(PRNT血清稀釋導致血小板減少90%gydF4y2Ba_{90年gydF4y2Ba})和50% (PRNTgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)被記錄為滴定度。額外的補充方法提供了技術細節部分gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

統計分析gydF4y2Ba

使用SPSS軟件進行統計分析(25)版本或GrapPad棱鏡(version 8)。gydF4y2Ba

倫理批準聲明gydF4y2Ba

所有的病人提供知情同意使用他們的數據和臨床樣本的目的本研究。機構審查委員會批準對病人數據的科學使用授予的治療機構倫理委員會的醫學院路德維希Maximillians慕尼黑大學(投票20 - 225 KB)。gydF4y2Ba

報告總結gydF4y2Ba

進一步研究信息設計是可用的gydF4y2Ba自然研究報告摘要gydF4y2Ba與本文有關。gydF4y2Ba