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摘要
簡介登革熱是亞太和拉丁美洲地區一個重要的、有充分記錄的公共衛生問題。然而，在非洲，關於疾病負擔的信息僅限於病例報告和零星暴發的報告，從而阻礙了為控製疾病而采取的公共衛生行動的實施。為了收集關於非洲沒有記錄的登革熱負擔的證據，在非洲的三個地點用標準化方法開展了流行病學研究。
和分析方法2014-2017年，登革熱疫苗行動在布基納法索瓦加杜古的三個地點開展了實地研究;Lambaréné，加蓬和肯尼亞蒙巴薩，以獲取登革熱可比發病率數據，並通過標準化的醫院監測和社區血清學方法評估其負擔。通過現場研究，包括基於設施的被動發熱監測、疾病費用調查、血清學調查和衛生保健利用調查，獲得了登革熱負擔的多學科測量結果。所有三個地點都使用標準化程序和統一的實驗室化驗診斷登革熱進行病例發現。進行了醫療保健利用調查，以調整發病率計算中不同醫療保健尋求模式的人口分母。發熱監測數據將允許使用多變量邏輯回歸計算登革熱患者和非登革熱患者之間按年齡分列的發病率和症狀表現的比較。血清學調查評估了每隔6個月在每個地點隨機選擇的約3000名居民的隊列的免疫狀態變化。按年齡分層的血清調查數據可計算登革熱的血清流行率和感染力。通過快速診斷測試對急性登革熱患者進行了疾病成本評估。
道德和傳播通過對非洲幾個地點的登革熱負擔評估方法進行標準化，這些研究將產生非洲登革熱負擔的證據，並將在2018年的同行評審期刊上發表數據。
- 登革熱
- 流行病學
- 公共衛生
- 熱帶醫學
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本研究的優勢和局限性
還沒有采用多學科方法進行的基於人口的研究(即在一個集水區人口中進行監測、保健利用和血清調查)。被動監測的數據將用於計算登革熱的年度發病率，血清調查的數據將用於估計感染的力量和流行程度。
這些研究基於標準化方法和實驗室算法，在非洲的三個地點進行。因此，可以按地點進行比較。
這不是一個隊列研究。以設施為基礎的被動監測可能導致低估登革熱負擔，因為它隻根據在我們的研究設施尋求治療的人來衡量發病率。
我們的研究結果在非洲其他登革熱流行地區的普遍性可能有限。
背景
登革熱是一種蚊媒黃病毒感染，由四種相關但抗原不同的登革病毒(denv，血清型1-4)引起，是一個迅速增加的主要全球公共衛生問題。最近的研究估計，全球每年發生5000萬至1億例有症狀的感染。1登革熱是一種高負擔疾病，對熱帶和亞熱帶國家的影響尤為嚴重，其中許多國家的醫療資源有限。2盡管最近在幾個登革熱流行國家批準了一種登革熱疫苗，但該疫苗限製了年齡和流行病學適應症。其他預防和控製措施，如病媒控製，作為單獨幹預措施並不理想，3 4目前還沒有治療藥物。
與亞洲和美洲一樣，19世紀末和20世紀初，非洲也報告了登革熱的流行。5個6特別是在非洲，1964年至1968年期間有尼日利亞DENV 2型登革熱病例報告的記錄。71960 - 1970年代在尼日利亞進行的幾項研究的數據表明，成年人和兒童的免疫力都相當高。8 92011年,編寫等對有關非洲登革熱的文獻進行了全麵綜述，並描述了非洲34個國家報告了登革熱病例，其中大多數國家也報告了登革熱病例伊蚊蚊子。6然而，先前的研究表明非洲存在登革熱，但其回顧性設計或樣本收集(獻血者或從其他疾病調查中收集的樣本)，以及通常來自旅行者的研究受到限製，這些研究報告了少量本地病例，以證明登革熱的真實、基於人口的負擔。此外，雖然亞洲和拉丁美洲的許多登革熱流行國家強製向公共衛生當局報告登革熱病例，並建立了監測發病模式的國家監測係統，10大多數非洲國家缺乏這種既定的報告機製，隻記錄了零星的疫情和個別病例報告。此外，登革熱的臨床表現往往不具有特異性，可能難以與非洲存在的無數其他傳染病區分開來，因為登革熱診斷化驗方法並不廣泛。因此，在非洲，登革熱的負擔在很大程度上仍然未知。6日11沒有這些登革熱負擔數據，就不可能在非洲就預防和控製措施作出知情的決策，包括引入登革熱疫苗。
由於監測能力有限，阻礙了該區域的持續報告，非洲沒有頻繁和係統的登革熱報告。眾所周知，非洲血統對嚴重的登革熱具有保護作用，最近在一名古巴患者身上發現了候選基因。12日13Bhatt等who的全球登革熱負擔模型表明，就感染人數(包括明顯的和不明顯的)相等而言，非洲的負擔與拉丁美洲一樣高。1有一些關於非洲登革熱的新發現，但關於該大陸登革熱問題的嚴重程度仍有很多未知之處。為了改進對非洲以人口為基礎的登革熱疾病負擔的估計，並利用經驗數據驗證非洲未登記的登革熱負擔是否與美洲一樣高，登革熱疫苗行動(DVI)在西部(布基納法索瓦加杜古)、中西部(Lambaréné，加蓬)和東非(肯尼亞蒙巴薩)的三個地點開展了實地研究。在這三個地點的每個地點，都有一套標準化的研究組成部分，包括基於設施的被動發熱監測、醫療保健利用調查、患病成本調查和血清學調查(圖1)，在2014年12月至2016年3月之間啟動。
對研究組成部分的描述，包括基於設施的被動發熱監測、衛生保健利用調查、患病費用調查和血清學調查。在學習包中有兩個手臂，由四個部分組成。在研究包中以衛生設施為基礎的部分中，在監測中嵌入了以設施為基礎的被動發熱監測和疾病費用調查。在研究的社區部分，有血清學調查和醫療保健利用調查。
方法
選址
選擇研究地點的部分依據是它們支持DENV傳播的可能性。為了選擇地點，我們考慮了文獻中的登革熱暴發和病例報告、現有的血清流行率研究以及DENV傳播概率的特定國家登革熱風險圖和登革熱存在的證據水平，報告了非洲登革熱共識估計的不確定性。7日14此外，還考慮到充分的研究基礎設施來執行這些研究。最後，包括非洲的不同區域也是選址的一個因素。例如布基納法索的瓦加杜古;Lambaréné、加蓬和肯尼亞蒙巴薩分別被選中，以測量西非、(西非-)中非和東非選定地點的登革熱負擔。
在布基納法索，由於DENV-2病毒，1982年瓦加杜古發生了第一次報告的登革熱疫情。62006年，在農村環境(Nouna村)和城市環境(瓦加杜古)中，孕婦和獻血者的登革熱抗體血清學流行率分別為26.3%和36.5%。15最近，萊德進行了一項觀察性研究等2013-2014年在選定研究機構谘詢的發熱患者中，8.7%(33/379)的登革熱快速診斷試驗(RDT)呈陽性，RT-PCR檢測的60個樣本中有15個呈登革熱陽性。16有了登革熱存在的證據，加上強大的衛生和人口監測係統(瓦加- hdss)可用於描述集水區的人口特征，2014年12月在布基納法索瓦加杜古啟動了一項實地研究。
在加蓬，報告了由多達三種不同DENV血清型引起的登革出血熱(DHF)病例，發現登革血清感染率在5%至20%之間。17日至19日最近發表的一項研究結果顯示，2007年至2010年，半農村地區Lambaréné約30個月大的幼兒血清陽性率為12.3%。20.然而，2005-2008年的另一項研究表明，加蓬農村地區的DENV傳播微乎其微。21後一項研究檢查了來自隨機選擇的村莊(約占加蓬所有村莊的10%)的個體的登革熱抗體。血液樣本用抗denv IgG和IgM捕獲ELISA檢測，發現隻有極低的IgG(0.5%)和IgM(0.5%)血清陽性率。基於這些低流行率，作者得出結論，在加蓬農村沒有DENV的活躍循環。然而，血清流行率低可能受到所用檢測方法敏感性低的影響，導致所選村民血液樣本池中假陰性結果發生率高和/或選擇偏差。222007/2010年研究中的血清流行率估計也可能受到黃病毒間IgG交叉反應導致假陽性結果的可能性的影響。21盡管如此，考慮到DENV在加蓬傳播的可能性，2015年3月Lambaréné在一個集水區人口約為7.7萬居民的社區啟動了一項實地研究，利用Lambaréné (CERMEL)醫學研究中心的臨床研究基礎設施，受益於進行了大規模第三期瘧疾疫苗試驗的經驗豐富的研究人員。23日24
在肯尼亞，根據當地數據，有更多關於登革熱存在的證據。在2007年肯尼亞艾滋病指標調查的艾滋病毒陰性調查樣本的回顧性檢測血液標本中，登革熱是最常見的病毒病原體。使用商業試劑盒或CDC檢測，通過IgG ELISA對登革熱以及基孔肯雅熱和裂穀熱進行抗體檢測;12.5%為登革熱陽性。25同樣，一項家庭調查發現，蒙巴薩701戶家庭中13%的人有過去或現在感染DENV的血清學證據。26這些數據表明，肯尼亞的登革熱病例比公共衛生報告所顯示的要多，這可能是由於誤診。25日26日2016年3月，在肯尼亞蒙巴薩啟動了一項實地研究。
研究參與者
對於基於被動設施的發熱監測，符合以下標準的個人有資格參加研究:
年齡1-55歲。
參與研究的醫療保健設施覆蓋的集水區居民，在12個月內不打算搬離集水區。
年齡在7歲(肯尼亞為13歲)至17歲之間的兒童需簽署知情同意書和同意。
當前發燒(腋窩溫度≥37.5°C)或發熱史持續時間≤7天，無局限性體征(由局部感染引起的發燒以及已知和確認的除登革熱以外的病因的發燒，如經瘧疾RDT確認的瘧疾，如患者識別標準操作程序[SOP]中所列)。
對於血清學調查，采用標準1-3。在保健利用情況調查中，從參加血清調查的每個家庭中邀請戶主或家庭代表進行了家庭訪談。
研究區域和人口
布基納法索位於西非，人口為14 017 462人。該國主要是農村，據報道，2014年約29%的人口生活在城市地區。然而，布基納法索正在快速城市化，並被定位為過去25年城市化速度第四快的國家。27 28首都瓦加杜古人口為2 741 128人。大多數人口生活在城市環境中。大約45%的人口在15歲以下。29全市分為12區52區。瓦加杜古是該國最大的城市，也是文化和經濟中心。該市是蘇達諾-薩赫勒地區的一部分，每年降雨量約為800毫米。雨季從5月到10月，平均溫度28°C(82°F)。寒冷的季節從12月持續到1月，最低平均溫度為16°C(61°F)。在從3月到5月的炎熱季節，溫度可高達43°C(109°F)。
在瓦加杜古設立了高級別支助係統。瓦加市人口支助係統監測81 717名居民;根據該監測係統，城市人口非常穩定，遷移率為4.1%，超過80%的居民擁有自己的房子[20]。該城市和研究區域的地圖見圖2．
布基納法索瓦加杜古的研究區域地圖。
加蓬位於中非西海岸，麵積近27萬平方公裏(10萬平方公裏)。米)，人口估計有150萬。其首都和最大城市是利伯維爾。據報道，2014年，87%的加蓬人口生活在城市地區。28第六大城市Lambaréné是Moyen-Ogooué省的省會，位於赤道以南75公裏處，2009年人口為25257人。Lambaréné的大多數居民生活在半農村地區。加蓬約42%的人口在15歲以下。29同樣，Lambaréné的人口相對年輕，約50%的人不到20歲。
加蓬的保健服務主要是公共的，但也有一些私人機構。擁有該區域最好的醫療基礎設施之一，幾乎90%的人口都能獲得保健服務。Albert Schweitzer醫院(ASH)是一家私人機構，作為被動發熱監測研究的研究地點。30 31Lambaréné的研究區域見圖3．
加蓬Lambaréné的研究區域地圖。
肯尼亞位於東非，位於赤道上，國土麵積為581 309公裏2(224 445平方。小米)，2014年人口約4500萬。32肯尼亞一般是溫暖濕潤的熱帶氣候，但也有不同的氣候，從首都內羅畢周圍較冷的氣候，到內陸炎熱幹燥的氣候，以及東北地區與索馬裏和埃塞俄比亞邊境的沙漠氣候。32首都內羅畢是地區商業中心。主要產業包括農業、出口茶葉和咖啡以及服務業。
肯尼亞分為47個半自治縣。蒙巴薩是該國僅次於內羅畢的第二大城市，位於該國東海岸。32行政上，蒙巴薩是蒙巴薩縣的首府，蒙巴薩縣的前身是沿海省。整個海岸地區覆蓋了8萬多公裏2位於肯尼亞東南部，約占該國土地麵積的15%，居民有3 325 307人。
蒙巴薩的主要經濟驅動力是旅遊業和貿易業。蒙巴薩本身的人口約為130萬，其中近50%的人口在15歲以下。29該省的人口越來越多地居住在城市地區;目前約45%的人口居住在蒙巴薩和其他城市中心。“長雨”期大約在4月開始，“短雨”期從10月開始。32年平均氣溫為24°C至27°C，但1月至4月的平均最高氣溫超過30°C。
圖4顯示了蒙巴薩的姆維塔郊縣的區域，這是肯尼亞研究的集水區，集水區人口為74 735居民。這張地圖顯示了參與研究的三個設施。
肯尼亞蒙巴薩的研究區域地圖。
樣本大小
由於在研究國家或鄰近國家缺乏可獲得的針對年齡的登革熱發病率數據，因此在計算樣本量時很難獲得基於人口的發病率來進行假設。基於文獻中有限的數據，粗略估計了基於被動設施的發熱監測所需的集水區人口。每年的發病率估計數是根據現有的流行率估計數計算的，假設所關注的結果在0歲時的流行率為零，並且感染力是恒定的。假設對某一特定年齡組的患病率估計數將根據年度發病率進行調整，並適用於所有年齡組。
Wichmann等通過比較三個隊列研究的數據和東南亞國家的監測數據，計算出兒童的生長因子。33對於泰國的兒童，5歲以下兒童的特定年齡擴張因子為11.85,5 - 9歲為8.76,10-14歲為7.81。33結果顯示，即使在有更好的報告和監測係統的亞洲，也存在相當程度的報告不足。就非洲而言，可能有更多的登革熱病例未得到確定(未尋求治療)和報告不足(即使登革熱患者尋求治療也未報告，因為登革熱不是非洲的常規應報告疾病之一)，但目前沒有關於登革熱低估程度的此類信息。34 35此外，我們在樣本量計算中使用的發病率估計也不是來自基於人群的研究。雖然根據可能的低估進一步調整發病率是理想的，但由於缺乏數據，無法根據可能的低估報告調整樣本量計算中使用的年度發病率。在95%的置信水平下計算樣本量，在固定顯著性水平下的誤差範圍為發病率真實比例的25%。考慮到研究地區登革熱發病率證據的差距，這提供了75%的相對精確度。最終的樣本量是通過假設10%-20%(因站點不同而不同)的無反應率或隨訪損失來計算的。在布基納法索進行發燒監測研究所需的集水區人口規模估計為10萬人，加蓬為7.7萬人，肯尼亞為7萬人。在這些集水人群中，入選受試者的數量取決於在研究設施中尋求治療的合格患者的數量。在我們的研究設施中有多少符合條件的發熱發作是很難預測的;但是在評估了這些設施中發熱患者的數量後，在大約1.5年的研究期間，登記的現實上限被設定為3000名受試者，以便向所有同意的合格患者提供登記。
對於血清學調查，同樣使用基於已發表文獻的流行比例計算樣本量。布基納法索的血清陽性率為0.304，150.123加蓬、21肯尼亞為0.14436被使用。在相同的置信水平和允許的誤差範圍下，假設10%-30%(因站點而異)的不回複率，計算樣本量為每個站點3000名參與者。同樣，由於來自選定國家的數據稀缺，沒有報告其他流行率估計數或來自不同年齡組的估計數。由於患病率預計將隨著年齡的增長而增加，而較高的患病率將提供較小的樣本量，因此我們的計算可能是保守的。
研究組件
發熱監測設計與方法
為了確定在布基納法索、加蓬和肯尼亞的三個地點中每個地點因症狀性登革熱造成的負擔，在一個明確界定的集水區人口中實施了基於設施的被動發熱監測。在布基納法索，2014年12月在瓦加杜古市的五個選定的初級保健中心啟動了監測研究，這些中心在當地被稱為“Santé和社會促進中心”，集水區人口為105,000居民。該項目是與博博-迪烏拉索的穆拉茲中心、EQUITE sante方案(蒙特利爾大學與設在瓦加杜古的行動-古維恩斯-整合-強化、AGIR的合作方案，由加拿大衛生研究所資助)和DVI合作實施的。在加蓬，與CERMEL和德國圖賓根熱帶醫學研究所合作，在為Moyen-Ogooué和Lambaréné範圍內的13萬居民提供集水區人口的ASH中啟動了監測研究。在肯尼亞，與肯尼亞醫學研究所和肯尼亞衛生部合作，在Ganjoni藥房、都鐸縣醫院和海岸省總醫院為蒙巴薩的7萬居民提供服務，實施了監測研究。
中描述的圖5，所有在指定研究設施的門診及住院病人，均符合上文所述的納入標準，首先接受SD登革Duo RDT測試。登革確診通過用PCR檢測血清樣本中的登革病毒，以及用ELISA檢測急性期和恢複期血清中的抗登革IgM和IgG抗體(SD登革IgM和IgG捕獲ELISA檢測，標準診斷公司，Yongin-Si，韓國)。10 37在研究期間，每個符合入選標準的連續患者都有資格參加。1歲以下的嬰兒由於操作限製，如嬰兒出血困難，未納入研究。
發熱監測中的患者流量。符合條件的發熱患者被確定並登記為研究對象，按照這些步驟完成參與被動發熱監測。*少量ELISA或NS1陰性的樣本進行PCR檢測，以排除ELISA假陰性結果。CRF，病例報告表。
在布基納法索瓦加杜古，發燒監測於2014年12月開始，並持續到2017年2月(約2年)。加蓬Lambaréné於2015年4月開始進行發燒監測，並持續到2017年1月(約1.5年)。在肯尼亞蒙巴薩，發燒監測於2016年3月開始，並持續到2017年5月(15個月)。
在參與發燒監測的受試者中，登革熱快速診斷測試呈陽性的受試者被進一步納入疾病成本調查，包括急性疾病就診當天的訪談、第一次就診後的第10-14天以及如果病情持續的第28天。疾病費用調查問卷的目的是估計在研究設施中確定的登革熱陽性患者的直接醫療、直接非醫療和間接費用。這項調查還估計了在設施層麵治療登革熱的費用。通過將患者門診就診、住院就診和服務消費(如診斷檢測、藥物和提供給患者的其他服務)的醫療記錄聯係起來收集數據。研究的疾病費用部分將單獨描述。
發燒監測- - - - - -實驗室檢測
所示圖6在所有三個地點，急性樣本均使用商用快速檢測試劑盒檢測登革熱NS1和IgM/IgG(登革Duo, Standard Diagnostics, Yongin-Si，韓國)。急性疾病就診當天(第1天)在患者就診現場使用登革Duo RDT。隨後在當地實驗室使用登革IgM/IgG ELISA (SD登革IgM & IgG捕獲ELISA, Standard Diagnostics, Yongin-Si, Korea)對急性和恢複期樣本進行檢測。按照同意文件的規定，分離血清並儲存在約500 μ L的4等份中，用於各種實驗室試驗。
登革熱實驗室檢測算法。被動發熱監測受試者的樣本將遵循檢測算法的這些步驟，以確認登革熱。*登革熱二人組®對登記的發熱患者進行檢測，以確定登革熱病例，以便在疾病費用調查中立即隨訪登革熱確診病例。**選定樣本，包括IgM和NS1在登革Duo上檢測陽性的樣本®，以及IgM和IgG捕獲ELISA陽性者，采用RT-PCR檢測。
經過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)後，樣品被運往韓國國際疫苗研究所(IVI)。RDT或ELISA檢測結果為陽性的樣本，以及少量檢測結果為陰性的樣本，在IVI臨床免疫學實驗室進行RT-PCR進一步檢測。四種DENV血清型特異性實時RT-PCR測定方法用於實驗室確認登革熱和血清型。38DENV 1-4 RT-PCR檢測在25µL反應混合物中進行，其中包括5µL模板RNA、TagMan快速病毒1步主拌(Applied Biosystems)、每個引物0.9µM和0.2µM探針。38擴增和檢測在StepOne Plus實時PCR係統中進行，基線和閾值使用StepOne軟件V.2.2.2(應用生物係統)中的自動基線和閾值功能確定。熱循環參數為:50°C逆轉錄5min, 95°C失活20s, 95°C熒光檢測45個循環，3s, 60°C退火30s。38如果在40個周期內記錄目標擴增，則認為標本為陽性。
血清學調查設計與方法
雖然以設施為基礎的發熱監測研究提供了對醫療治療登革熱疾病負擔的估計，但需要對人群中的所有DENV感染(包括影響免疫狀態的亞臨床和輕度症狀感染)進行評估，以了解登革熱的總體影響。作為整套研究的一部分，在用於發燒監測的同一流域人群中進行了基於人群的血清學調查。在非洲的三個地點，對瓦加杜古、Lambaréné和蒙巴薩城市和半城市地區隨機抽取的大約3000名居民進行了血清調查。在沒有Lambaréné和蒙巴薩所有居民個人層麵的人口普查信息的情況下，在社區/村衛生工作者的幫助下，根據社區(或衛生工作者/誌願者負責的確定地區)作為集群單元進行了隨機分組。由於社區/村衛生工作者熟悉村莊及其居民，他們是進入社區的良好切入點。在這些衛生工作者的幫助下，實地工作隊根據每個社區的家庭密度，在選定的村莊中，每5-7戶人家敲門，對房屋進行篩選。此外，以前在同一地區進行的研究項目中收集的人口資料，如有，也用作指南。就瓦加杜古的這一地點而言，有高密度支助係統的數據，蒙特利爾大學的EQUITE SANTE是國際人權研究所資助的一個研究方案，它建立了研究地區房屋的地理信息係統數據庫。利用這些數據，在瓦加杜古隨機預選了血清調查潛在入選者的家庭，並進行了家庭訪問。在這三個地點，大約45%的血清調查樣本將從1至14歲的兒童中收集，55%的血清調查樣本將從15至55歲的成年人中收集，以反映該地區一般人口的年齡分布。 Household-based enrolment was offered to the head of the household until the specific cap for the age-group was reached in Lambaréné and Mombasa.
隨機選擇年齡在1-55歲的受試者，分別在雨季前和雨季後進行兩次放血(兒童5ml，成人7ml)，間隔約6個月。基線時和6個月後分別用IgG間接ELISA法檢測血清。將利用每隔6個月出現一次登革熱IgG抗體來估計隱性DENV感染的發生水平，並計算集水區人口的感染率。基於流式細胞術的DENV中和試驗將應用於一個樣本子集，以評估在6個月的間隔內是否存在登革熱中和抗體和血清轉換。除了總體血清轉換外，還將確定流域人口中年齡特異性血清轉換估計數以及隱性感染的比例。
血清學survey-laboratory測試
從血清調查中收集的樣本中，使用約200 L的血清，並在當地實驗室使用登革熱IgG ELISA (Panbio登革熱IgG間接ELISA, Alere North America, Florida, USA)進行檢測。在當地實驗室對登革熱IgG進行ELISA檢測後，樣本被運往國際疫苗研究所。鑒於黃病毒之間潛在的血清學交叉反應性，39基於流式細胞術的中和試驗將在IVI的臨床免疫學實驗室對選定的黃病毒進行，除DENV 1-4外，還包括黃熱病病毒、西尼羅河病毒、寨卡病毒和日本腦炎病毒。40 41在布基納法索的4次出血和加蓬和肯尼亞的2次出血中，每次大約50個樣本將被檢測。
在此過程中，約1000 L的血清被分配。基於流式細胞術的中和試驗在96孔細胞培養板中重複進行，每個孔均含有表達dc - sign的U937細胞。40在實驗中使用的病毒數量感染了7%到15%的細胞。連續稀釋人體免疫血清，並將病毒與血清在37°C下預孵育1小時。40清洗細胞，將病毒和血清混合物添加到細胞中，在37°C下培養1小時，然後在37°C的5% CO中進一步培養24-48小時2．細胞被固定、滲透，並用識別黃病毒E蛋白的熒光偶聯單克隆抗體4G2染色。42FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson, San Diego, California, USA)用於分析細胞。40使用Prism 4.0軟件(GraphPad software, San Diego, California, USA)通過非線性劑量-響應回歸分析計算中和50%病毒的血清稀釋度。
此外，將對隨機選擇的子樣本進行基於luminex的多重免疫分析，以評估不同黃病毒的IgG。43在布基納法索的4次出血和加蓬的2次出血中，每次出血將檢測約200個樣本。將在IVI臨床免疫學實驗室使用內部基於微球的多重免疫分析法(arpo - mia)對患者血清樣本進行寨卡病毒IgG和四種DENV血清型中的每一種IgG檢測。44 45arpo - mia是一種微球混合物，與果蠅S2表達係統中產生的DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4或ZIKV重組抗原(E蛋白結構域III)共價偶聯。簡單地說，用1:400稀釋的患者血清樣品，在黑暗中連續振蕩孵育微球混合物，2µg/mL抗人IgG生物素偶聯抗體(Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania, USA)和2µg/mL鏈黴生養素- r -phycoerythrin偶聯物(Life technologies)。最後孵育後，使用BioPlex 200儀器(美國加利福尼亞州赫爾克裏斯Bio-Rad實驗室)對每個微球組的中位熒光強度(MFI)進行量化。如果獲得的病毒抗原與對照抗原的MFI值的比值高於規定的臨界值，則認為樣本為血清陽性。通過使用特征良好的血清進行工作特征(ROC)曲線分析，確定每種病毒抗原的MIA臨界值。
在Lambaréné，登記出血發生在2015年11月至12月，而第二次采血發生在2016年5月。在瓦加杜古，登記出血於2015年5月至6月進行，隨訪采血時間分別為2015年12月、2016年6月和2017年1月。在蒙巴薩，2016年5月進行了采血，2016年11月- 2017年2月進行了第二次采血。
醫療服務利用率調查
由於被動的發熱監測是在研究設施中進行的，如果潛在的登革熱患者在其他地方尋求治療，他們可能會被遺漏。為了確定被動監測係統可能因患者生活在研究區域但在研究設施之外尋求治療而遺漏的發熱和登革熱病例的比例，在研究集水區隨機選擇的400個家庭中進行了一項基於人群的醫療保健利用調查，以描述當家庭成員(自我報告)出現發熱發作時家庭的醫療保健利用模式。除了評估居民的求醫行為外，還調查了求醫行為方麵的偏好及其偏好的各自原因。這份問卷向400名戶主發放。在參加血清調查的3000名居民中，約有600戶。從這些家庭中隨機挑選了400名戶主，讓他們參加保健利用情況調查。向戶主或家庭中的一名高級代表提出了關於其家庭成員尋求健康模式的問題。
研究調查問卷
對於發熱監測研究，在急病訪視和恢複期訪視時進行問卷調查。恢複期探訪可以在醫療機構(10-14天後)或在患者家中(急性探訪後15-21天)進行，根據患者的偏好和可用性。問卷由研究機構的醫務人員完成，包括人口統計和臨床信息(如體征、症狀、既往病史、處方治療和診斷)。同樣的工作人員也在急性期就診後21天內完成了恢複期隨訪問卷。研究護士完成監測登記日誌。實驗室技術人員完成了實驗室部分(主要是與登革熱相關的診斷)，表格由研究協調員在現場編製。
對於血清調查部分，在每次血清調查來訪時，由訓練有素的現場團隊工作人員對家庭進行問卷調查。研究護士在進行了簡短的身體和醫療檢查後完成了問卷。在大約6個月後的隨訪中，同樣的工作人員進行家庭訪問以完成隨訪問卷。注冊記錄由研究協調員在現場維護。
統計分析計劃
根據發燒監測數據，將計算在研究設施中尋求醫療保健的患者中有症狀的登革熱發病率。所有兒童和成人的年齡特異性發病率將根據監測時研究地區一般人口的規模和分布作為計算有症狀登革熱病例發病率的分母來確定。假設居住在研究區域的每個人貢獻了12個月的個人時間為分母。雖然所有研究地區都報告移民率較低，但假定在研究期間人口的遷入與遷出是平衡的。症狀性登革熱的年齡特異性發病率將通過使用年齡特異性分母和合格個體的症狀性登革熱病例數作為分子來計算。
利用在醫療保健利用調查中收集的數據，將確定被動式監測係統遺漏的發熱病例的比例。然後使用比例，分子將進一步調整，以識別那些來自研究區域的遺漏的發燒病例，這些病例可能是登革熱。此外，還將在符合資格的潛在參加者中比較同意參加和拒絕參加的參加者。將審查登記日誌，其中記錄了在篩選潛在登記人員過程中獲得的基本信息。除了檢查我們的發熱病例樣本是否代表集水區一般人群的發熱患者外，拒收率將根據日誌中的信息確定。然後，拒絕率將被用來調整分子。
采用SPSS軟件對發熱監測數據進行分析。基於從所有經血清學和RT-PCR實驗室確診的登革熱患者收集的體征和症狀，將使用多變量logistic回歸來比較登革熱確診患者與非發熱登革熱患者在症狀表現方麵的差異，並對可能的混雜因素進行調整，如年齡、發熱天數、原發性與繼發性感染、住院與門診等。還將使用多變量邏輯回歸確定按年齡和血清類型劃分的登革熱(DF)(以及登革出血熱(DHF)症狀複合體的差異(如果數據允許的話)。
由於門診疾病占登革熱疾病負擔的大部分，DENV感染個體的臨床特征將根據治療類型(住院vs門診)以及疾病的嚴重程度(根據2009年世衛組織標準，嚴重vs非嚴重)來確定。46分類在病程結束後確定(通常在恢複期訪問期間)。有症狀的登革熱分為門診或住院。登革熱的進展記錄為DF、DHF I、DHF II、DHF III或DHF IV，臨床模式將根據嚴重程度進行比較。46個47這些結果將與拉丁美洲(哥倫比亞)和亞洲(泰國、越南和柬埔寨)的其他DVI研究的結果進行比較。總的來說，將在布基納法索、加蓬和肯尼亞進行比較。
有了反映該國一般人口年齡分布的年齡分層血清，血清學調查抽樣策略確保有足夠的受試者，以獲得集水區人口血清陽性率和血清轉換的精確年齡特異性估計。血清轉換率和免疫狀態的變化將在研究期間按年齡組確定。年齡分層的血清調查數據還可以計算研究人群中登革熱的感染力。在入組後，有些受試者在6個月後的隨訪中退出。將完成參與的研究對象與未完成參與的研究對象的基本人口信息進行比較，以確定研究對象是否代表集水區人口。布基納法索、加蓬和肯尼亞將進行比較。
道德的考慮
為了盡量減少研究給患者帶來的不便，我們對臨床醫生和護士進行了有關研究要求和程序的敏感性培訓，以便將數據收集納入患者的日常護理。入選研究的臨床醫生和護士在整個研究過程中都得到研究現場工作人員的協調支持。研究人員從患者處獲得7名(肯尼亞13名)- 17歲的受試者的書麵知情同意書和同意。研究人員通過同意和同意文件，對疾病進行簡短總結，詳細描述研究程序和報銷信息。患者數據記錄在研究指定的辦公室;隻有研究人員才能訪問被刪除的數據。數據由學習室獨家處理，並安全存儲在學習室和DVI主服務器的受保護數據庫中。
討論
自20世紀60年代以來，非洲就發現了登革熱病例，而且一直存在伊蚊大陸上的帶菌者。5 7然而，在非洲開展的登革熱研究很少，基於人口研究的證據也很少。6與來自東南亞和美洲的證據量相比，關於非洲登革熱的關鍵數據缺乏。對非洲登革熱負擔嚴重的懷疑是基於有限的疫情報告和少量血清流行率研究，在樣本中檢測不同的病毒，這些樣本可能不代表一般人群。在我們實地研究所選擇的三個國家，可以獲得的數據有所增加，但仍然非常有限。在布基納法索，2013年進行的一項觀察性研究報告稱，8.7%的發熱患者在登革熱RDT檢測中顯示陽性結果。16在加蓬，一項研究表明，農村地區的DENV循環極小，21另一項研究報告，在Lambaréné半農村地區30個月大的學步兒童中，登革熱IgG抗體的血清流行率為12.3%。20.在肯尼亞，經RT-PCR和IgM抗登革熱ELISA檢測，在2013年暴發後，蒙巴薩約13%的人報告有DENV過去或目前感染的證據。26盡管這些研究的範圍和可推廣性有限，但它們表明，由於低估和誤診，可能存在比以前所認識到的更多的登革熱病例。25日26日
這些研究表明，在我們的實地研究國家中存在登革熱和某種程度的潛在血清流行率。然而，這些研究往往受到其回顧性設計或樣本收集(獻血者或從其他疾病調查中收集的樣本)的限製，以證明登革熱真正的、基於人群的負擔。我們建議在西非、中非西部和東非通過基於人群的登革熱監測和血清流行率研究來彌補這一差距。
目前在非洲三個地點進行的研究將提供關於非洲無證DENV流通的重要資料。這些數據將有助於加強非洲登革熱負擔的證據基礎。根據我們的研究更好地確定疾病負擔數據可用於評估登革熱預防和控製措施的相對需求，例如登革熱疫苗是否會成為非洲國家具有成本效益的公共衛生幹預措施。我們研究的臨床結果也可作為登革熱病例發現和病例管理的指南。
這些研究有一些重要的局限性。我們認識到登革熱流行病學隨時間和地區的變化。由於資源的限製，我們的研究在時間框架和地理範圍上受到限製。這些限製可能會限製我們研究結果的可推廣性。
在估計有症狀的登革熱發病率時，一個潛在的偏差來源是由於存在相關症狀的社區居民向其他衛生保健提供者和設施而不是研究設施尋求治療而未得到充分確定。由於研究設計仍然是被動監測，因此僅在我們的研究設施中確定病例。通過估計發熱患者在其他地方尋求治療的比例，以及在篩選合格標準的潛在登記者中拒絕接受治療的比例，可以確定該研究遺漏的發熱患者的程度。作為發病率計算的調整，將使用反概率加權來解釋這些被監測遺漏的潛在受試者。此外，根據登革熱或其他伴有發燒的共循環疾病的傳播量，可能會有患者被診斷出患有其他疾病，並被排除為登革熱。此外，關於我們的血清學調查的登革熱診斷，在非洲有其他流行的黃病毒，導致在確定過去登革熱感染的抗體方麵存在挑戰。雖然我們的檢測計劃評估了一些黃病毒，但其他已知在非洲傳播的病毒，如Banzi病毒和Usutu病毒，不屬於檢測計劃的一部分。48-50由於資源限製，血清學檢測將僅限於黃熱病病毒、西尼羅病毒、寨卡病毒和日本腦炎病毒以及DENV 1-4。因此，在某些情況下，可能很難根據血清學數據確定以前接觸DENV與其他黃病毒的區別。這種交叉反應可能導致對登革熱感染力的高估。
此外，血清調查和醫療保健利用調查是在集水區人口的隨機子樣本上進行的，從這些調查中收集的數據可能具有有限的普遍性。由於同意參與和不同意參與的人之間存在未知的差異，數據可能不能代表研究國家的一般人口。
結論
從我們的研究中收集的數據將有助於評估布基納法索、加蓬和肯尼亞的未知登革熱負擔。這些數據可以填補該地區未記錄的登革熱負擔的空白，並可共同用於推斷西部、中部和東部非洲其他地區的登革熱負擔。由於許多其他相互競爭的公共衛生問題和有限的資源，非洲國家可能不會將引進登革熱疫苗作為近期的優先事項。為了具有成本效益地實施公共衛生幹預措施，需要從流行病學研究中獲得關於登革熱負擔的準確數據，以便決策者就控製和預防登革熱作出循證決策。我們的研究將提供一些非常需要的基於人口的研究信息，以評估非洲的登革熱負擔。
致謝
我們感謝瓦加杜古、阿什科什、甘約尼藥房、都鐸縣立醫院和海岸省總醫院以及穆拉茲中心、塞梅爾和KEMRI的醫生和化驗室工作人員。我們感謝AGIR、法國IRD、蒙特利爾大學和圖賓根大學的合作者。最後，我們要感謝DVI團隊以及國際疫苗研究所的統計人員、實驗室和行政人員，感謝他們在撰寫本文期間提供的有益意見和研究期間的支持。
參考文獻
腳注
貢獻者JKL設計了這項研究，監督數據收集，是撰寫手稿的主要貢獻者。MC參與設計了這項研究，監督了部分數據收集，並支持了手稿的寫作。JSL在設計研究和監督部分數據收集方麵作出了貢獻。KSL在監督數據收集方麵作出了貢獻。數據采集支持SN、SKL、EA、NO、AB。VR支持了研究的設計，並在手稿的定稿中做出了主要貢獻。JF是數據收集方麵的貢獻者。BL是研究設計和數據收集的貢獻者。SHM在研究的設計和場地的建立方麵做出了貢獻。ME是該研究設計的貢獻者之一。 EB supported in data generation. SMN was a contributor in designing of the study and site establishment. STA and SY were contributors in designing of the study and site establishment. NA was a major contributor in providing oversight of the data collection and finalisation of the manuscript. IKY was a major contributor in designing of the study and finalisation of the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.
資金目前的研究得到了比爾和梅琳達·蓋茨基金會(OPP 1053432)的資金支持。NA得到聯合王國醫學研究理事會和國際發展部的支持(MR/K012126/1)。VR是cihr資助的應用公共衛生研究主席(cppp -137901)。
免責聲明供資機構在設計研究和收集、分析和解釋數據以及撰寫手稿方麵沒有任何作用。
相互競爭的利益沒有宣布。
病人的同意獲得的。
倫理批準每項研究的方案都獲得了國際疫苗研究所機構審查委員會、倫敦衛生和熱帶醫學院以及東道國機構倫理委員會的倫理批準，包括肯尼亞科學與倫理研究所科學和倫理審查股、加蓬國家倫理委員會和機構倫理委員會，加蓬CERMEL的科學審查委員會和蒙特利爾大學'Universitéde Montréal醫院中心的倫理委員會以及布基納法索的國家衛生倫理委員會。
來源和同行評審不是委托;外部同行評議。
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