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摘要
簡介產生廣譜β -內酰胺酶(ESBL)的腸杆菌科首次被描述與醫院獲得性感染有關。在2000年代，產生esbl的生物的流行病學發生了變化，特別是產生esbl大腸杆菌越來越多地被描述為社區獲得性感染的重要原因，這支持了一種假設，即近年來產生esbl的腸杆菌科可能是被輸入到醫院的，而不是相反。產生ESBL的腸杆菌科的傳播是複雜的，因為ESBL基因編碼在自我傳播的質粒上，這些質粒可以在相同和不同的細菌物種之間交換。本研究項目的目的是量化產ESBL腸杆菌科在醫院範圍內的細菌種類和移動遺傳元素的傳播，並確定由ESBL生產者引起的醫院獲得性感染是否與主要在社區或醫療保健環境中流行的菌株和移動遺傳元素有關。這種區別在預防中至關重要，因為前者強調迫切需要建立或加強抗生素管理計劃，而後者則需要更嚴格的感染控製。
方法與分析該方案提出了一項觀察性研究，將在瑞士巴塞爾大學醫院和巴塞爾市進行。產生esbl的腸杆菌科將從常規臨床實踐或在住院和門診環境中通過主動篩查獲得的任何標本中收集，以及從廢水樣本和食品中收集，這兩種標本在12個月內每月收集一次，用於全基因組測序分析。細菌染色體、質粒和esbl基因序列將在隊列內進行比較，以確定人類與其環境之間的遺傳相關性和遷移。
倫理與傳播本研究已被當地倫理委員會(Ethikkommission Nordwest-und Zentralschweiz)批準為質量控製項目(project - id 2017-00100)。這項研究的結果將發表在同行評議的醫學期刊上，並告知參與者、公眾和所有相關利益攸關方。
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- Esbl
- 同一健康
- 流行病學
- 質粒
這是一篇開放獲取文章，根據創作共用屬性非商業(CC BY-NC 4.0)許可證發布，該許可證允許其他人以非商業方式分發、混音、改編、在此作品的基礎上進行構建，並以不同的條款許可其衍生作品，前提是原始作品被正確引用且使用是非商業性的。看到的:http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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本研究的優勢和局限性
本研究采用跨學科的“單一健康”方法，使用最先進的技術來調查不同的來源，以娛樂和促進目前流行的廣譜β -內酰胺酶(ESBL)產生腸杆菌科。
單中心研究設計可能會限製對其他環境的通用性。
缺乏對進入和離開醫療機構的所有患者的係統監測可能會導致漏診的傳播事件。
所獲得的關於產esbl腸杆菌科在細菌種類和移動遺傳元件水平上傳播的知識將為製定具體措施以防止進一步傳播提供良好的基礎。
簡介
產生廣譜β -內酰胺酶(ESBL)的腸杆菌科的傳播對全球醫療機構實施有效感染控製措施以限製進一步的醫院傳播提出了挑戰。產生esbl的腸杆菌科於1983年首次被描述1從那時起，在全球範圍內迅速增加。在21世紀，產生esbl的生物的流行病學發生了特別的變化大腸杆菌生產CTX-M ESBL型越來越多地被描述為全球社區獲得性尿路感染的重要原因，2支持了近年來產生esbl的腸杆菌科可能被輸入醫院的假設，而不是相反。可能的社區來源包括食物3.以及全球旅行導致的殖民，尤其是印度次大陸。4此外，在瑞士河流和湖泊的水樣中發現了產生esbl的腸杆菌科，5可能構成了一個被低估的抗生素耐藥性傳播的暴露途徑。產生ESBL的腸杆菌科的傳播進一步複雜化，因為ESBL基因編碼在自傳播質粒上，這些質粒可以在相同和不同種類的腸杆菌科之間交換。然而，這種攜帶ESBL基因的質粒在腸杆菌科之間的水平轉移對ESBL生產者的流行病學的貢獻仍然是難以捉摸的，因為質粒的結構靈活，沒有合適的參考序列，因為它們遠不如細菌染色體保守，因此對質粒的分析具有挑戰性。
總的來說，菌株、質粒和可能的基因的多層次傳播，以及不同的儲存庫，如醫療機構、食品和水，需要使用“單一健康”方法進行調查，以闡明當前ESBL流行的最重要驅動因素。目前缺乏關於這些不同來源具體作用的詳細知識，盡管這是在衛生保健機構中製定有效感染控製幹預措施以限製進一步傳播的關鍵要求。菌株分型是研究傳播的前提。直到最近，脈衝場凝膠電泳或多位點序列分型(MLST)等技術被認為是參考標準6；然而，它們缺乏區分密切相關菌株的決心，而這是更深入地了解當前ESBL流行所需要的。此外，這些技術不能區分可移動的遺傳元件。7全基因組測序(WGS)允許以盡可能高的分辨率識別區分染色體和可移動遺傳元件的單核苷酸多態性(SNPs)，因此能夠通過係統發育分析研究菌株和質粒的相關性，並最終導致對傳播途徑的詳細探索。8迄今為止，該技術尚未應用於大型流行病學研究，包括臨床相關的產esbl腸杆菌科菌株和從社區環境中恢複的分離株，以確定菌株和質粒的傳播。我們機構的一個關鍵資源是自2003年以來從住院和門診常規臨床實踐中獲得的任何標本中恢複的所有產esbl腸杆菌科的菌株收集，代表了隨著時間的推移臨床相關菌株的獨特收集。
宗旨和目標
本研究項目旨在研究產esbl腸杆菌科在細菌染色體和移動遺傳元素水平上的傳播，並確定醫院獲得性感染的來源。這些數據對於預防至關重要，因為社區獲取強調迫切需要建立或加強抗生素管理計劃，而醫院獲取則需要更嚴格的感染控製。具體目標包括:
通過評估產esbl腸杆菌科在患者之間和隨時間的遺傳相關性，量化醫院範圍內產esbl腸杆菌科的傳播程度
評估水平基因轉移對產esbl腸杆菌科在醫院和社區環境中傳播的貢獻
通過比較從患者和環境中恢複的菌株和質粒的遺傳相關性，作為一種“單一健康”方法，確定產生esbl的腸杆菌科在人類及其環境(即食物和廢水樣本)之間的遷移。
方法與分析
設置
巴塞爾大學醫院是一個三級學術護理中心，每年接待超過35000名成人患者，擁有813張病床。它在巴塞爾市(約有20萬人口)提供急症護理和醫院服務，是瑞士西北部需要專門醫療護理的病人的轉診中心。它的門診部提供一般和專門醫療服務。
為配合現行指引，本機構實施以下感染控製措施:
主動監測ESBL運輸
自2003年以來，所有從住院和門診常規臨床實踐中獲得的任何標本中恢複產esbl腸杆菌科的患者都進行了常規篩查，以確定進一步的定植位點。此外，所有已知攜帶ESBL的患者在再次入院時都要進行篩查。此外，在我們的機構對以下患者人群進行常規ESBL攜帶篩查:(1)與定植或感染產生ESBL的腸杆菌科患者在同一房間住院至少24小時的所有患者，(2)自2013年以來，入住重症監護病房並需要機械通氣的患者，(3)自2015年以來，所有直接從國外醫院轉移的患者和所有入院的庇護尋求者。對ESBL攜帶的篩查可通過直腸拭子、任何開放傷口或引流的拭子以及使用弗利導尿管患者的尿樣進行。9
標準預防措施
自1999年以來，我們機構已經實施了標準的預防措施。它們包括正確使用手衛生(如世衛組織和疾病控製與預防中心指南所示)10 11根據美國疾病控製與預防中心指南概述，禁止與患者接觸，並在涉及接觸體液的程序中使用個人防護設備(即手套、長袍、口罩和護眼)。10
接觸的預防措施
接觸預防措施包括分配到一個單獨的房間，以及醫護人員和訪客在入口時使用手套和長袍。10
截至1999年，對所有感染或定植產生esbl腸杆菌科的患者實施了接觸預防措施。從2012年1月起，停止對感染或定植產生esbl的患者采取接觸預防措施大腸杆菌，是根據我們機構的低傳播率發現的。12
巴塞爾大學醫院微生物實驗室的菌種收集
自2003年1月以來，所有從瑞士巴塞爾大學醫院住院和門診常規臨床實踐中獲得的標本中回收的產esbl腸杆菌科分離株都被收集並保存在臨床微生物科，這代表了臨床相關菌株的獨特收集。如果分離日期距離檢測到第一株菌株超過2個月，則收集和存儲來自同一患者的係列分離株。
研究設計
我們建議采用兩階段方法:
回顧性研究(針對研究目標1和2):將對2003年1月至2016年12月在巴塞爾大學醫院收集的代表性ESBL菌株進行WGS。將評估攜帶產生ESBL的腸杆菌科遺傳相關菌株的患者與攜帶各自ESBL基因的遺傳相關質粒的病例之間的流行病學關係(定義如下)。
前瞻性研究(針對研究目標1和2以及補充研究目標3):WGS將對巴塞爾大學醫院在2年的研究期間收集的代表性ESBL菌株進行，樣本來自醫院和巴塞爾市的廢水係統，以及從醫院和巴塞爾市收集的食品樣本。在1-2年內，將每月從巴塞爾市十個郵政編碼區的兩個商店收集食品，並從汙水網絡係統的代表性地點收集廢水樣本。將評估患者之間的流行病學關係(定義如下)，以及具有產生ESBL的腸杆菌科遺傳相關菌株的環境樣本和攜帶各自ESBL基因的遺傳相關質粒的病例。
流行病學資料和分類
我們係統地評估了以下數據，並提供給所有入住我們機構或在門診治療的患者:人口統計數據，整個醫院的移動(包括住院期間占用的房間和病房的詳細信息)，家庭郵政編碼區和分配的一般醫療實踐。
遺傳相關病例之間的流行病學關係將分類如下:
病房接觸:在同一時間段或出院後1周內在同一病房住院的患者
醫院病房接觸:在同一時間段或出院後1周內在同一醫院病房住院的患者
全院接觸:在同一時期或出院後1周內住院的患者
門診接觸:在同一門診或同一全科診所接受門診治療的患者
社區接觸(患者之間):居住在同一郵政編碼地區的患者
社區接觸(患者與環境之間)患者、來自同一郵政編碼地區的食品樣本和/或廢水樣本。
樣品收集
患者樣本
自2003年1月以來，瑞士巴塞爾大學醫院住院和門診環境中通過常規臨床實踐或主動篩查(如上所述)獲得的任何標本中恢複的所有產esbl腸杆菌科均已收集並儲存在臨床微生物科。這項收集將在整個研究期間繼續進行。
廢水樣品
在研究的未來階段，廢水樣本將每月收集一次。與巴塞爾市土木工程部門(Tiefbauamt Basel Stadt)合作，選擇了20個反映城市不同郵政編碼區域的特定采樣點(每個郵政編碼區域兩個)。此外，廢水將從巴塞爾大學醫院的主要廢水出口收集。
食品樣本
在本研究的預期階段，食品樣品將每月收集一次。食品將從不同郵政編碼地區的兩家商店購買。此外，食物將從醫院的廚房收集。13日14基於先前證實瑞士食品中存在產esbl腸杆菌科的研究結果，我們計劃對以下食品進行調查:家禽13(在50%的樣品中檢測到ESBL生產者，個人交流，巴塞爾-施塔特Kantonales Laboratorium Basel-Stadt)，新鮮草藥，豆芽15(在17%的樣品中檢測到ESBL生產者，個人交流，巴塞爾施塔特Kantonales Laboratorium Basel-Stadt)和沙拉。本地和進口產品都將進行抽樣。16
樣品處理
根據巴塞爾大學醫院臨床微生物實驗室的常規診斷程序，將為ESBL生產商分析患者標本。食品和環境樣品將與當地衛生當局(巴塞爾施塔特Kantonales Laboratorium Basel-Stadt)密切合作進行處理。被鑒定為產生ESBL的分離株將接受WGS進行進一步的流行病學調查。
基於WGS的分子流行病學
將在兩個重要層麵上使用WGS對esbl產生者的傳播和傳播進行調查。首先，我們將分析細菌的染色體序列，以跟蹤細菌的傳播。這將允許檢測產生esbl的細菌的典型傳播。其次，我們將分析esbl編碼質粒，看看是否在細菌菌株之間發生傳播。質粒的傳遞甚至遊離質粒的攝取都可能導致ESBL在不同的細菌譜係之間甚至在不同的腸杆菌科物種之間傳播。
為了識別細菌及其質粒的傳播事件，我們將結合不同的WGS方法，如Illumina和長讀測序技術。對於細菌染色體的分析，將應用各種方法進行比較，以獲得所有菌株之間最準確的係統發育關係。核心基因組MLST和基於snp的方法將在這方麵進行評估。
在第二部分中，我們將比較上述染色體係統發育與類似的ESBL質粒分析產生的染色體係統發育，以便我們可以觀察到水平轉移。使用WGS，我們生成與染色體序列平行的每個分離物的質粒信息。我們目前正在建立一個基於等位基因的分析管道，詢問所有分離基因組的組裝，以尋找質粒複製子的存在，17編碼ESBL酶和其他抗生素耐藥性的基因。
定量數據分析和建模
根據測序數據，我們將揭示有和沒有流行病學聯係的患者聚集在一起的程度，從而為細菌菌株的傳播提供一個代理。在質粒係統發育中有顯著的聚類，而菌株的染色體係統發育有更大的分歧，這將表明水平基因轉移。此外，評估2012年巴塞爾大學醫院忽略接觸隔離預防措施前後的細菌和移動元素的傳播率，將增強我們對醫院環境中多重耐藥傳播的認識，從而直接影響醫療保健環境中的接觸隔離政策。
所有基於WGS的係統發育將使用BEAST V.2.0進行推斷18使用我們之前開發的工具來量化傳輸速率。19BEAST是一種貝葉斯推斷工具，它考慮了在這種密切相關的病原體數據中觀察到的係統發育不確定性。此外，BEAST推斷樹的分支長度表示日曆時間，使我們能夠將樹中的傳播時間與流行病學聯係起來。
在最後的“同一健康”方法中，我們將使用基於來自患者、食物和廢水樣本的ESBL菌株的係統發育來確定細菌和質粒在這些不同來源之間的傳播量。再一次，係統發育被解釋為傳播的代理。如果來自不同來源(如醫院、食品和廢水)的菌株或可移動遺傳元件在係統發育中相互聚集，而來自不同來源的菌株在係統發育中不混合，則表明來源之間的相互作用非常有限。然而，來自不同來源的菌株在係統發育過程中的混合表明了來源之間的持續傳播。傳播事件的量化將使我們能夠分析每個來源對人類ESBL感染的貢獻。
數據分析和建模的方法可在項目執行期間作某些修改
限製
這項研究有一些重要的局限性。單中心研究設計可能會限製對其他環境的通用性，並且缺乏對所有進入醫療機構的患者的係統監測，可能會導致漏報傳播事件。為了擴大我們的研究範圍，下一步，我們的菌株還可以與其他研究的基因組進行比較，以便將我們的菌株與全球收集的菌株進行對比。對共享質粒標記的分離物進行更詳細的分析(例如，兩個分離物共享相同的ESBL編碼基因和至少一個相同的複製子序列)將需要優化基因組數據的組裝。ESBL質粒非常大(高達200 kb)，在組裝方麵存在技術挑戰。我們目前正在評估幾種策略。首先，通過排除染色體序列優化生物信息學數據分析管道，改進從頭序列組裝。其次，對純化質粒進行測序，可以獲得比全基因組測序更高、更均勻的覆蓋範圍，從而實現更好的組裝。因此，我們目前正在測試各種商業上可用的試劑盒，以有效地回收如此大的質粒。第三，長讀測序策略的應用。 Pacbio and MinION sequencing yield read lengths of several kilobases. The combination of multiple technologies will improve the quality of the genome assemblies obtained by Illumina, either by scaffolding the previously obtained contigs or by performing de novo assembly with the long reads and further quality control with the short Illumina reads. Fourth, we will use already established tools such as Placnet20.根據腳手架、覆蓋和數據庫比較等附加信息重建質粒。最後，從關鍵參考菌株獲得的完整質粒序列將與已發表的抗性質粒序列一起納入本地數據庫，可作為更詳細地計算質粒的親緣性和傳播的參考。根據一個全麵的質粒數據庫進行映射將使我們能夠徹底分析所有質粒的相關性。該數據庫還可以發布並向公眾提供，以促進質粒傳播的下遊項目。
倫理與傳播
我們計劃在國家和國際科學會議上介紹這個研究項目的結果。我們的目標是在開放獲取的期刊上發表我們的研究結果，使感興趣的國際觀眾可以廣泛地獲得它們。我們的目標是將我們的測序數據提供給研究界，以便在國家和國際層麵上評估菌株和質粒的分布。這樣一個數據庫可以為跟蹤疫情暴發和機構和國家之間的傳播提供可靠的基礎。
我們希望我們的研究結果能夠為醫療保健機構的感染控製策略提供信息。巴塞爾大學醫院傳染病和醫院流行病學部將相應地調整感染控製幹預措施。在國家層麵，我們的實施合作夥伴將是瑞士國家預防和預防組織(SwissNoso)，該組織發布了醫療保健機構感染控製措施的國家指南，以及瑞士傳染病學會和聯邦公共衛生辦公室，後者目前正在製定國家抗生素管理幹預措施戰略。
我們的研究結果可能揭示食品是ESBL生產者的相關傳播來源，並可能建議改變廢水管理。州一級的主管當局(州實驗室，隸屬於州衛生當局)直接參與了這一研究項目。
致謝
我們要感謝巴塞爾市土木工程部(Tiefbauamt Basel Stadt)的團隊提供了汙水樣本的獲取和收集。我們還要感謝巴塞爾大學醫院臨床微生物科的團隊收集的臨床樣本。
參考文獻
腳注
貢獻者TS和DM:共同申請人，參與了方案的設計，並對本文的智力內容進行了評審。LA-B, AE和HSS:對測序方法提出建議，審查了本文的知識內容。JH:對係統發育分析提出建議，並審查了這篇論文的知識內容。RS:就環境采樣策略提供建議，並審查了本文的知識內容。LE, PB, PH, CB:對環境樣品的采集和分析有貢獻，並對本文的智力內容進行了評審。STS:首席研究員、通訊作者;發起、設計和起草議定書;協調所有合作。
資金這項工作得到了瑞士國家科學基金會(407240_167060)的支持，作為國家研究計劃(NRP72)“抗菌素耐藥性”和Gottfried & Julia Bangerter-Rhyner基金會的一部分。
相互競爭的利益ST-S是Astellas Fidaxomicin谘詢委員會的成員，也是MSD的成員梭狀芽孢杆菌顧問委員會。她獲得了安斯泰來公司的無限製研究經費。
病人的同意不是必需的。
倫理批準本研究已被當地倫理委員會(Ethikkommission Nordwest-und Zentralschweiz)批準為質量控製項目(project - id 2017-00100)。
出處和同行評審不是委托;提交前需經過同行評審，以獲得倫理和資金批準。
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